主要用途

冰冻切片神经组织金属锌改良蒂姆（Neo-TIMM）染色试剂是一种旨在使用新型蒂姆硫化法银染技术，分

析存档中的冰冻组织切片里神经系统中含锌神经细胞结构分布的权威而经典的技术方法。该技术经过精心改良蒂姆（Timm）方法、成功实验证明的。主要适用于冰冻脑组织（海马齿状回门区 hilus of dentate gyrus、安蒙氏角 cornu ammonis、大脑皮层、丘脑、杏仁核 amygdala nuclei 或外周神经组织切片，例如海马

（hippocampus）中苔藓纤维区（mossy fiber region）和齿状分子层（dentate molecular layer）等含锌神经细胞体，例如锥体细胞（pyramidal cells）、齿状颗粒细胞（dentate granule cells）等检测。广泛用于脑神经病理生理，尤其是退行性神经病变包括癫痫、自闭症、精神分裂症、脑损伤、脑缺血等疾病的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

蒂姆硫化法银染（Timm’s sulfide silver staining）是由蒂姆建立的用于观察脑组织和其它组织中（例如胰腺、小肠、睾丸、肾脏等）微量金属元素锌，以及其它重金属元素，例如铜、镍、钴和铁等的染色技术。主要用于观察中枢神经系统中含锌神经元，以及新轴突分枝（sprouted axon）和轴突终端（axon terminal）等结构，分析大脑灰质内部的海马中轴突终端（突触泡囊 synaptic vesicle）、苔藓终端（齿状颗粒细胞 dentate granule cells）中的反应性锌的分布，与突触活性和膜去极化的关系，研究神经退行性和癫痫病理性变化机制。其原理在于使用硫化物，与组织中的游离金属元素反应成为不溶性复合物沉积，进而在还原剂的作用下，金属硫化物催化还原离子银为可见金属银沉积，呈现黑色，此为金属自显影术（autometallography， AMG）。新型蒂姆硫化法银染技术（neo-TIMM）具有显示（visualization）改善的优点。

产品内容

硫化液（Reagent A） 毫升

固着液（Reagent B） 毫升

清理液（Reagent C） 毫升

染色液 A（Reagent D） 毫升

染色液 B（Reagent E） 微升

产品说明书 1 份

保存方式

保存在 4℃冰箱里，避免光照；有效保证 3 月

用户自备

PBS 缓冲液：用于灌注无离子水：用于组织清洗

1.5 毫升离心管：用于工作液配制的容器无菌镊子：用于转移动物脑组织

小型玻璃染色缸：用于组织或切片处理的容器切片机：用于组织切片

明胶化载玻片和盖玻片：用于切片后铺片中性树脂：用于切片封片

光学显微镜：用于切片染色后观察分析

实验步骤

一、 样本固着处理

1. 常规麻醉动物和手术（建议：使用用户自备的 4℃预冷的 PBS 由心脏处灌注约 5 至 10 分钟，去除血液直至澄清，肝脏显示灰白）

2. 使用适量的（xx 毫升）4℃预冷的硫化液（Reagent A）灌注处理（建议：至少 10 分钟，肝脏显示发黑）

3. 使用适量的（xx 毫升）4℃预冷的固着液（Reagent B）灌注处理

4. 即刻小心取出脑组织（组织显示蓝灰色调）

5. 小心放进 xx 毫升固着液（Reagent B）里

6. 置于 4℃冰箱里浸泡孵育 60 分钟

7. 转移到 xx 毫升硫化液（Reagent A）里

8. 置于 4℃冰箱里浸泡孵育 30 分钟

9. 即刻用无菌镊子夹起组织块

10. 放进用户自备的无离子水清洗 2 分钟

11. 用绵纸吸干组织快

12. 即刻进行常规 4℃冰箱里 30%蔗糖脱水过夜和 OCT 处理后包埋

13. 在－20℃条件下进行缓慢冰冻切片，为 30 微米厚，并铺片在明胶化载玻片上

14. 置于－20℃冰箱里保存二、 样本染色处理

染色开始前，取出染色液 A（Reagent D）置于室温下预热，然后移取 xx 毫升染色液 A（Reagent D）到

1.5 毫升离心管，加入 xx 微升染色液 B（Reagent E），混匀后，标记为染色工作液，置于暗室里备用。然后进行下列操作

1. 取出 10 片待测的 30 微米厚的冰冻组织切片

2. 小心加上 xx 微升清理液（Reagent C）铺满整个切片样品表面

3. 小心移去切片上的清理液（Reagent C）

4. 小心加上 xx 微升染色工作液，铺满整个切片样品表面

5. 26℃温度下孵育 50 分钟，避免光照

6. 小心移去切片上的染色工作液

7. 室温下，小心将切片置入 xx 毫升清理液（Reagent C）中孵育 10 分钟

8. 小心移去切片上的清理液（Reagent C）

9. （选择步骤）进行复染操作（建议使用甲苯酚紫（CRESYL VIOLET）复染试剂盒－HL80052 或中性

红复染试剂盒）

10. 透明处理

11. 放上盖玻片或封片（中性树脂）

12. 即刻在一般光学显微镜下观察：含锌神经细胞体，例如锥体细胞、齿状颗粒细胞、突触泡囊等，呈现黑色（如果复染――细胞核呈现蓝色，胞浆尼氏（体）物质呈现粉红至紫色）

13. 齿状回内分子层苔藓纤维出芽（mossy fiber sprouting）评分

14. 其它结构区域染色评分

注意事项

1. 本产品为 10 次操作，其中 20 次染色操作

2. 操作时，须戴手套

3. 铺片须使用明胶化载玻片，否则染色会掉片：第一用毛笔涂刷；第二保持湿润 3 小时；第三用 PARAFIN

包裹后压片

4. 切片建议 30 至 50 微米，过厚和过薄不利于检测神经细胞

5. 注意操作安全，尤其使用固着液（Reagent B）

6. 建议使用玻璃染色缸

7. 每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干

8. 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面

9. 整个操作，在避光状态下进行

10. 染色完成后，即刻进行光学显微镜观察

11. 样品染色后保存，避免光照

12. 锌分布参考图像如下：ao（olfactory bulb）：嗅球；cp（caudate putamen）：尾状壳核；am（amygdala）：杏仁体；h（hilus of dentate gyrus）：齿状回门区；s（subiculum of dentate gyrus in mossy fibers）：苔藓纤维齿状回门下脚；IV（IV layer of neocortex）：新皮质 IV 层

13. 本公司提供系列神经系统成分染色试剂产品

14. 

质量标准